凝膠層析分離的一般原理和操作方法

一、目的要求：

1. 學(xué)習(xí)與掌握親和層析和凝膠層析分離的一般原理和操作方法。

2. 了解自動化純化設(shè)備基本組成和原理。

3. 了解親和吸附層析瓊脂糖、凝膠過濾葡聚糖的基本性質(zhì)。掌握組氨酸標(biāo)簽蛋白的基本性質(zhì)和純化原理和操作；掌握緩沖液置換和脫鹽的原理和操作。

二、實(shí)驗概述（如右圖）

實(shí)驗步驟：

1. 樣品預(yù)處理：即通過超聲這種細(xì)胞破碎的手段，將在大腸桿菌E.coli中表達(dá)的重組的帶6個His標(biāo)簽的綠色熒光蛋白釋放到相應(yīng)的緩沖液當(dāng)中，再通過離心，0.2微米濾膜過濾等去除細(xì)胞碎片和別的污染物；

2. 組氨酸標(biāo)簽蛋白親和層析：HisTrapTMHP crude, 1mL預(yù)裝層析柱，進(jìn)行親和層析，一步就可以達(dá)到90%左右的純度

3. 凝膠過濾層析脫鹽去除咪唑：HiTrapTM  Desalting 5mL預(yù)裝層析柱進(jìn)行脫鹽，置換緩沖液

4. 電泳：對純化過的樣品的檢測。

三、設(shè)備以及試劑準(zhǔn)備（試劑均使用化學(xué)純以上）：

1. 儀器：核酸蛋白檢測儀HD系列、自動部分收集器BSZ\DBS系列、恒流泵HL系列

2. 樣品：EGFP原液

3. 層析柱：HisTrap HP 1ml, 1根；HiTrap Desalting 5ml，1根

4. 層析緩沖液

5. 注射器，燒杯，負(fù)壓脫氣瓶等實(shí)驗室常用容器

四、實(shí)驗內(nèi)容

1. 儀器和實(shí)驗準(zhǔn)備：

所有緩沖液需要過0.2um膜過濾，負(fù)壓脫氣抽濾瓶脫氣，脫氣裝置如圖所示

樣品預(yù)處理：即通過超聲這種細(xì)胞破碎的手段，將在大腸桿菌E.coli中表達(dá)的重組的帶6個His標(biāo)簽的綠色熒光蛋白釋放到相應(yīng)的緩沖液當(dāng)中，再通過離心，0.45 微米濾膜過濾等去除細(xì)胞碎片和別的污染物；用注射器吸取大于2ml樣品

將注射器內(nèi)的樣品從樣品環(huán)3號口推入，注意不要將氣泡推入樣品環(huán)(如右圖)。